SILAC蛋白定量試劑盒及試劑

對(duì)于差異蛋白表達進(jìn)行定量分析。

在細胞培養中使用氨基酸進(jìn)行穩定的同位素标記（SILAC）是鑒定和定量複雜蛋白樣(yàng)品中相關差異的變化的一種(zhǒng)有效的方法。SILAC方法通過(guò)體内代謝將(jiāng)“重的”13C-或15N标記的氨基酸整合到蛋白中然後(hòu)進(jìn)行質譜（MS）分析以便加快對(duì)蛋白的測定、鑒定、定量和理解。

應用：

•  可以使用專門針對(duì)幹細胞的試劑盒對(duì)幹細胞分化中的蛋白進(jìn)行鑒定。

•  可以對(duì)不同細胞處理後(hòu)的蛋白豐度的相關變化進(jìn)行定量的分析。

•  可以對(duì)沒(méi)有抗體的蛋白進(jìn)行定量分析。

•  正常細胞vs.疾病細胞的蛋白表達譜的繪制。

•  可以在一個實驗中對(duì)成(chéng)千上萬的蛋白進(jìn)行鑒定和定量。

産品特點：

标記物能(néng)夠100%的整合到活細胞的蛋白中。

• 可重複 – 降低由于樣(yàng)品制備不同而造成(chéng)的實驗内差異。

• 靈活 – 培養基中缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸兩(liǎng)種(zhǒng)氨基酸，因此可以通過(guò)兩(liǎng)種(zhǒng)氨基酸的同位素标記更加完全的覆蓋整個蛋白質組。

• 通用 – 可以對(duì)多種(zhǒng)在DMEM或RPMI 1640培養基中能(néng)夠培養的哺乳動物細胞中表達的蛋白進(jìn)行标記，這(zhè)些細胞包括HeLa，293T，COS7，U2OS，A549，A431，HepG2，NIH 3T3，Jurkat及其它。

• 兼容– 可以通過(guò)分化培養基測定人間質幹細胞或小鼠胚胎幹細胞中調節發(fā)育的重要蛋白。

        SILAC需要在含有輕或重的必需氨基酸的培養基中培養哺乳動物細胞；例如，分别含有12C6及13C6 L-賴氨酸。常規的實驗包括在含有輕氨基酸（對(duì)照）的培養基中培養一批細胞，同時(shí)在含有重氨基酸（實驗組）的培養基中培養相同的另一批細胞。輕、重氨基酸通過(guò)自然的細胞内蛋白合成(chéng)的過(guò)程整合到蛋白中。在對(duì)一個樣(yàng)品進(jìn)行化學(xué)處理或者遺傳操作使其蛋白質組發(fā)生變化之後(hòu)，將(jiāng)從兩(liǎng)種(zhǒng)細胞中得到的蛋白等量的混合在一起(qǐ)，然後(hòu)利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離并利用胰酶進(jìn)行消化然後(hòu)進(jìn)行MS分析。由于标記有重和輕氨基酸的多肽在化學(xué)性質上是完全相同的，因此這(zhè)兩(liǎng)種(zhǒng)多肽在反相柱洗脫時(shí)是同時(shí)洗脫的，因此能(néng)夠在MS分析中同時(shí)檢測到兩(liǎng)種(zhǒng)多肽。然後(hòu)就(jiù)可以利用來自于每種(zhǒng)蛋白的同位素标記的多肽的相

         對(duì)峰強度來确定處理後(hòu)的樣(yàng)品的蛋白豐度的變化。（見下圖）我們提供幾種(zhǒng)不同的Thermo Scientific Pierce SILAC試劑盒，還(hái)提供能(néng)夠支持不同類型的哺乳動物細胞系生長(cháng)的培養基，這(zhè)些細胞系甚至包括人間質幹細胞和小鼠胚胎幹細胞。每個試劑盒都(dōu)包括同位素标記細胞所需的所有試劑，這(zhè)些試劑包括培養基、重和輕氨基酸對(duì)以及透析過(guò)的血清。幾種(zhǒng)同位素标記的賴氨酸和精氨酸都(dōu)是單獨提供的，因此可以進(jìn)行多重實驗和分析。當與Thermo Scientific蛋白/多肽樣(yàng)品富集産品結合使用時(shí)，可以使用Pierce SILAC蛋白定量試劑盒對(duì)低豐度蛋白進(jìn)行MS分析，這(zhè)些低豐度蛋白包括細胞表面(miàn)蛋白、細胞器特異性蛋白以及磷酸化蛋白或糖蛋白這(zhè)些經(jīng)過(guò)翻譯後(hòu)修飾的蛋白。

SILAC實驗流程示意圖。

利用含有0.1毫克/毫升的重13C6 L-賴氨酸-2HCl或輕L-賴氨酸-HCl，并且含有10%透析過(guò)的FBS的SILAC DMEM培養基（産品貨号：89983）培養A549細胞，培養六代（10天）。在完全标記後(hòu)，利用5 μM喜樹堿（Sigma，St. Louis，産品貨号C9911）處理13C6 L-賴氨酸标記的細胞24小時(shí)。利用Thermo ScientificM-PER哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑（産品貨号：78501）裂解來自每種(zhǒng)樣(yàng)品（輕和重）的細胞。將(jiāng)樣(yàng)品按照使用Thermo Scientific BCA蛋白定量試劑（産品貨号：23225）測定的蛋白濃度進(jìn)行标準化，然後(hòu)從每種(zhǒng)樣(yàng)品中取50毫克并混勻，此後(hòu)利用4-20%的梯度十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析樣(yàng)品。利用Thermo Scientific GelCode藍色染色試劑（産品貨号：24592）對(duì)凝膠進(jìn)行染色，利用Thermo Scientific 膠内胰酶消化試劑盒（産品貨号：89871）對(duì)蛋白進(jìn)行消化和烷基化，最後(hòu)利用LTQ Orbitrap雜交質譜進(jìn)行分析。

實驗示例

        使用Thermo Scientific SILAC定量試劑盒，利用13C6L賴氨酸标記培養在DMEM培養基中的A549細胞，标記效率>98%。裂解喜樹堿處理過(guò)的重同位素标記的細胞，將(jiāng)其裂解液與對(duì)照組的裂解液等量混合，然後(hòu)利用SDS-PAGE對(duì)混合液進(jìn)行分離并利用胰酶進(jìn)行消化，最後(hòu)進(jìn)行MS分析。利用Thermo Scientific LTQ Orbitrap質譜通過(guò)MS/MS測序成(chéng)功的鑒定出了超過(guò)350種(zhǒng)蛋白。然後(hòu)利用Thermo Scientific Bioworks軟件包對(duì)鑒定出的多肽進(jìn)行定量，得到了與蛋白豐度相關變化對(duì)應的SILAC比例。

        鑒定出來的蛋白在喜樹堿處理之後(hòu)都(dōu)沒(méi)有蛋白豐度的變化；然而，重同位素标記的細胞中定量出的蛋白中20%的蛋白的量比對(duì)照組高（SILAC比例）1.5倍。喜樹堿處理後(hòu)被(bèi)上調的蛋白中有一種(zhǒng)蛋白是增殖細胞核抗原（PCNA），該蛋白會(huì)參與DNA修複（見下圖）。爲了驗證SILAC數據，通過(guò)蛋白免疫印迹對(duì)蛋白分别進(jìn)行定量（見下圖）。PCNA蛋白水平增加了1.9倍；然而3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）并沒(méi)有顯著的變化。由蛋白免疫印記确定的蛋白豐度的變化與SILAC的數據完全吻合。

使用SILAC所得的MS圖譜。通過(guò)MS來分析PCNA中含有輕和重（13C6）L賴氨酸的多肽（AEDNADTLALVFEAPNQEK）。含有13C6的L賴氨酸的重多肽的質譜的分子量增加了6Da并且由于多肽的離子化爲+2所以與輕多肽相比産生了質荷比（m/z）爲3的偏移。

通過(guò)蛋白免疫印迹比較喜樹堿處理後(hòu)A549細胞中蛋白水平的變化。通過(guò)4-20%的梯度SDS-PAGE分析輕（L）和重（H）樣(yàng)品各10毫克，并利用特異性的抗體進(jìn)行蛋白免疫印迹。

參考文獻

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Everly,P.A.,et al.（2004）.Mol & Cell Proteomics.3.7:729-735.

Levine, A.J.（1997）.Cell.88:323-331.

Mann,M.（2006）.Nature Reviews.7:952-959.

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